Seminar课程

小RNA介导的基因沉默机制 / 生命与海洋科学学院 / 莫蓓莘

表观遗传学与非编码小分子RNA

表观遗传学是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下,基因表达的可遗传的变化的一门遗传学分支学科。表观遗传的现象很多,已知的有DNA甲基化,组蛋白修饰、非编码RNA等,本课程主要介绍非编码小分子RNA介导的基因沉默机制。

长期以来,人们认为RNA只是基因表达过程中的中间环节,RNA的功能在于控制蛋白质的生物合成,因此,研究局限于参与蛋白质生物合成的tRNArRNAmRNA。近20年来,随着非编码小分子RNA的发现,相关的功能研究成为一大热点,涌现的科学成果极大深化人们对基因表达调控的理解。

RNA的分类

由于RNA的研究进展迅速,随着新类型的不断涌现,其分类也处在不断变化之中。目前主要根据小RNA分子的特征将其归纳为4类:microRNAmiRNA)、small interfering RNAsiRNA)、Piwi-interacting RNApiRNA)和long noncoding RNAlncRNA),其中miRNApiRNAsiRNA的研究较多,进展较快。

miRNA是一类内源的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA,位于基因组非编码区,具有高度保守性、时序性和组织特异性,在细胞内具有多种重要的调节作用,如细胞分裂、分生组织分化、程序性细胞凋亡、代谢和形态建成,并参与原癌基因作用。第一个被确认的miRNA是在线虫中首次发现的lin-4 let-7,随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRNA,迅速成为一大研究热点。

RNA干扰是siRNA诱导的转录后基因沉默。RNAi在生物体内普遍存在,且高度保守,是一种高效的、序列特异的基因沉默机制。siRNA是一类约20-25个核苷酸大小的双链RNA。与miRNA不同,它是由一条长的双链RNA剪切而成。内源性siRNA能够抑制转座子的活性并在战胜病毒浸染中发挥重要作用,此外也能够调节一些基因的表达水平,而病毒产生的siRNA可以干扰宿主细胞内正常的基因表达。

piRNA2006年在哺乳动物生殖细胞中发现的一类新型小分子RNA。它比以往发现的小分子RNA稍长一些,约含30个核苷酸,需要与Argonaute蛋白家族的Piwi亚家族蛋白结合才能发挥作用,并因此而得名。越来越多的文献表明,piRNA在生殖细胞的生长发育中的调控是由于Piwi-piRNA复合物引起的基因沉默导致的,但由于对piRNA的研究尚处于初级阶段,它的一些具体的功能和生源论尚在研究中。

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Ding SW (2010) Nature Reviews Immunology

本课程先介绍小RNA介导的基因沉默的发现过程,之后向同学们介绍小RNA的生物合成(dicing)和作用方式(slicing)、参与RNAi过程的主要蛋白质的结构、RNAi的特征及RNAi的抗病毒机制。本课程后半部分主要介绍miRNA介导的基因沉默机制,包括miRNA的发现、合成调控、降解、靶标识别和作用机制等。

参考文献

Aravin A, Tuschl T. Identification and characterization of small RNAs involved in RNA silencing[J]. FEBS letters, 2005, 579(26): 5830-5840.

Ding S W. RNA-based antiviral immunity[J]. Nature Reviews Immunology, 2010, 10(9): 632-644.

Fire A, Xu S Q, Montgomery M K, et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J]. nature, 1998, 391(6669): 806-811.

Guo S, Kemphues K J. par-1, a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed[J]. Cell, 1995, 81(4): 611-620

Hamilton A J, Baulcombe D C. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants[J]. Science, 1999, 286(5441): 950-952.

Hammond S M, Bernstein E, Beach D, et al. An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells[J]. nature, 2000, 404(6775): 293-296.

Hammond S M. Dicing and slicing[J]. FEBS letters, 2005, 579(26): 5822-5829.

Kim V N, Nam J W. Genomics of microRNA[J]. TRENDS in Genetics, 2006, 22(3): 165-173.

Lee R C, Feinbaum R L, Ambros V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14[J]. Cell, 1993, 75(5): 843-854

Napoli C, Lemieux C, Jorgensen R. Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans[J]. The plant cell, 1990, 2(4): 279-289.

Reinhart B J, Weinstein E G, Rhoades M W, et al. MicroRNAs in plants[J]. Genes & development, 2002, 16(13): 1616-1626.

Tabara H, Sarkissian M, Kelly W G, et al. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans[J]. Cell, 1999, 99(2): 123-132.

Vaucheret H, Nussaume L, Palauqui J C, et al. A Transcriptionally Active State Is Required for Post-Transcriptional Silencing (Cosuppression) of Nitrate Reductase Host Genes and Transgenes[J]. The Plant Cell, 1997, 9(8): 1495-1504



1. 长期以来,人们认为RNA只是基因表达过程中的中间环节,RNA的功能在于控制蛋白质的生物合成。那么,对于非编码小分子RNA,人们又是通过什么探究过程逐步认识到它对基因表达重要的调控功能呢?RNA干扰、植物和动物中的siRNAmiRNA又是怎么被发现的?从发现这些小分子RNA的实验中,你能得到什么启发?

2. RNA干扰是siRNA诱导的转录后基因沉默。RNAi在生物体内普遍存在,且高度保守,是一种高效的、序列特异的基因沉默机制。RNAi有什么重要特征,又是如何被发现的?这些重要发现的技术方法和成果如何应用于我们的实验课题中?


1.通过对相关学术前沿的介绍和邀请国内外知名专家开展主题讲座,培养学生的学术素养,把握最新的学术动态。

2.通过对文献资料的综合分析和主题发言、讨论,培养学生表达、交流和主动学习的能力。

3.通过课程学习和科学研究的有机结合,强化对学生科学方法的训练,培养学生的创新意识和科研能力。

 

课堂示例:通过文献阅读还原RNAi发现的历史过程

1990年,Napoli等将由强启动子控制的色素基因chs(查尔酮合酶)导入矮牵牛,以加深花的紫色,结果发现许多花瓣颜色并未加深,反而呈杂色甚至白色。他们把这一现象称之为共抑制(Cosuppresion),用以定义所转入外源基因和同源内源性基因的表达同时减弱的现象。

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Napoli C (1990) Plant cell

五年后,康奈尔大学的Guo在利用反义RNA技术特异性地抑制秀丽新小杆线虫(C. elegans)中的par-1基因的表达时,意外发现对照实验中给线虫注射正义RNA也能抑制par-1基因的表达,但产生该现象的原因一直未能解释清楚。

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Guo S (1995) Cell

直到1998年,Fire等才首次揭开这个谜底。他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注入线虫,基因抑制效应变得十分微弱甚至没有效应,而经过纯化的双链RNA却能够高效特异性地阻断相应基因的表达。于是他们认为Guo遇到的正义RNA抑制基因表达的现象就是由于体外转录所得的RNA中污染了微量双链RNA引起的。

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Fire A (1998) Nature

参考文献

Fire A, Xu S Q, Montgomery M K, et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J]. nature, 1998, 391(6669): 806-811.

Guo S, Kemphues K J. par-1, a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed[J]. Cell, 1995, 81(4): 611-620

Napoli C, Lemieux C, Jorgensen R. Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans[J]. The plant cell, 1990, 2(4): 279-289.


本课程注重培养学生分析问题、解决问题的能力。课程设计了大量科研实例,让学生对探究科学问题的方案,对实验结果进行分析。例如:目前小RNA代谢途径的框架经过科学家们多年的研究已经基本构建起来,但是还有很多细节问题有待解决,小RNA在植物体内以哪种形式运输尚不清楚。课程让学生设计实验,探究小RNA在植物体内运输的形式。根据学生们设计的实验,教师给出可能获得的实验结果,让学生们在课堂上进行分析、论证。下图是老师给出的实验结果,靶向叶脉的小RNA能沉默叶脉中的叶绿素合成酶,使叶脉处漂白,小RNA在植物体内的成功运输会导致漂白区域的扩散。实验中通过分别在叶脉区域和叶脉以外的区域阻断小RNS合成途径不同环节,然后观察漂白区域的扩散情况,引导学生们分析并论证小RNA在植物体内以哪种形式运输。这种教学方式深受学生欢迎,对学生思维能力的训练很有帮助。

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本课程是一年级硕士研究生的专业选修课,这门新课程同时也得到研究生部的Seminar 课程的支持,同学们对这门课程的兴趣也很大。课程内容为小RNA介导的基因沉默机制方面的学术前沿知识,侧重植物miRNA方面的研究,相对系统地介绍了小RNA的发现、分类、生物合成、作用方式、参与RNAi的主要蛋白质的结构、RNAi的特征、miRNA介导的基因沉默机制等。课程以理论授课为主,文献阅读和讨论贯穿始终,并邀请专家为同学们讲授最前沿的科学成果。

所邀请的专家进行的讲座,受到广大师生的欢迎,有部分老师、博士后研究员也前来听课,学生的课堂参与度高、表现积极,结课后对课程效果的评价良好。此次开课也有一定的不足,由于时间匆忙,缺少对学生课堂表现的过程性考核,可以通过主题演讲、实验设计等增强对学生自主探究学习能力的引导和培养,让学生们结合相应研讨专题,通过文献检索、资料分析及实验设计等多种手段,探讨分析问题和解决问题的途径和方法,撰写研究报告,并通过课堂口头报告形式进行汇报。作为研究生教育,要继续努力将实验室的科学研究与本课程课堂教学有机联系在一起,在教学实践中培养学生的科研思维和实践能力。



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一、教学设计

1.学生在课前阅读与内容相关的经典研究论文,预先提出重点和问题。

2.教师复习或总结上节课的知识,引入本节课所要学习的内容,或通过一两个科学问题引导学生的思考从而引入课堂学习。

3.教师展示已做好的PPT,将抽象的难以理解的内容转化为学生容易接纳的知识,在课堂上引导学生讨论,随时听取和解决他们的疑难点。

4.结合学生课前阅读的文章,分组进行讨论,小组内合作学习解决问题,教师巡视、部分参与和引导小组的讨论。

5.小组总结和交流本节课的学习成果,教师对小组讨论及整个授课内容进行总结。

二、教学内容

1. RNA介导的基因沉默的发现(discovery)和案例研究——2课时。

2. RNA的生物合成(dicing)和作用方式(slicing——4课时。

3. 参与RNAi过程的主要蛋白质的结构(structure of RNAi players——2课时。

4. RNAi的特征(systemic RNAi——2课时。

5. RNAi的抗病毒机制(antiviral RNAi——2课时。

6. miRNA的研究历史(miRNA history——2课时。

7. miRNA合成调控(miRNA biogenesis regulation——4课时。

8. miRNA降解(degradation——2课时。

9. miRNA靶标识别(miRNA target recognition——2课时。

10. miRNA介导的作用机制(modes of action——4课时。

11.学生文献阅读、综合分析和讨论——5课时。

12.专家主题讲座和分析讨论。——5课时。



1.主讲教师深入浅出的讲解,包括对上节课知识的复习总结,本节课所学课程的引入,通过科学问题引导学生的思考和讨论,听取和解决学生提出的疑难点。

现场效果图:

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2.邀请国内外知名专家,开展主题讲座和分析讨论。

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深圳大学特聘教授、美国加州大学河滨分校教授、美国科学院院士陈雪梅为同学们带来最前沿的科研成果的分享

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英国剑桥大学教授David Baulcombe的专题讲座现场

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中国科学院曹晓风院士的专题讲座现场

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中国科学院田世平研究员的专题讲座现场

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美国加州大学河滨分校Anthony H.C. Huang教授的专题讲座现场



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