Seminar课程

光学显微与电子成像 / 光电工程学院 / 严伟


光学显微与电子成像的现状

显微成像技术是指借助物理方法获得待测样品放大图像的一类技术的总称,能够实现这种技术的设备则一般统称为显微镜。虽然最早的显微镜是何人于何时发明的一直存在争议,也已经难以考证,但确定无疑的一点是,显微镜的发明、发展和应用在人类发展史上具有非常重要的里程碑式的意义,因为正是它将人类的视野从宏观世界扩展到了微观领域,使人们得以在微观领域去寻找生命现象的本质规律,去探求疾病的发生和发展过程。显微成像技术根据照明光源性质的不同,通常可分为光学显微成像、电子显微成像、X射线显微成像等,限于课时,本课程主要介绍光学显微成像技术。

光学显微成像发展到今天,已经衍生出许多不同的类型,分别适用于不同的应用需求。例如根据获取图像方式的不同,目前常用的光学显微成像技术可分为宽场显微成像和扫描显微成像两大类:前者采用平行光或非聚焦光照明样品,通过眼睛观察样品放大的像,或利用面探测器进行成像,一次曝光即可获得整个视场范围内的显微图像,成像速度通常可以很快;而后者采用聚焦点光源照明样品,每次仅照明样品中一个微小的区域,采用点探测器收集光信号,再通过逐点扫描和重构获取图像,成像速度虽然没有宽场成像快,但可以结合“共聚焦”概念和非线性光学效应等实现更多更强大的成像功能,如激光扫描共聚焦显微成像、多光子激发荧光显微成像等。在图像对比度(也称为衬度)的形成方面,既可以利用样品对照明光的吸收、相位调制等来形成图像,也可以利用样品中特定的分子在激发光照射下产生的荧光、高阶谐波等来形成图像,相应地存在形式多样、系统复杂程度和适用领域各不相同的多种显微镜。

由于受光学衍射极限的影响,传统光学显微成像的分辨率最高约为入射光波长的一半。近二十年来,超分辨显微成像技术突破了这一极限,将显微成像技术的分辨能力推进到了纳米尺度,并在许很多前沿科学研究中得到很好的应用,促进了生命科学研究的快速发展。

我校光学显微与电子成像的发展现

深圳大学光电工程学院是在光电子学研究所基础上建立的一个教学科研并重型学院,在院所创始人牛憨笨院士的带领下,我院建立了围绕光电与测控领域的完整学科群。我们对生物医学光子学学科的建设高度重视。光电实验总建筑面积8200平方米,设施先进、功能完善、配套齐全、专业化水准高,其中有1200平方米的百级、千级和万级净化实验室。拥有150余台套,总价值近亿元的先进教学和科研仪器设备,建立了显微测量、光谱分析、超快诊断技术、材料分析及器件性能测试、生物光子学、显示测试、应用光学、电信号测量等测试分析实验室和专业实验室;并先后建成广东省光电子器件与系统重点实验室光电子器件与系统教育部重点实验室(深圳大学)国家高技术863光电诊断技术重点实验室深圳市生物医学光学微纳检测与成像重点实验室

深圳大学光电工程学院生物光子学课题组研究方向主要利用新型光学成像/谱检测的技术和手段,实现对活细胞或活体动物生命过程可视化的研究,从而为理解生命活动提供直观、精细、实时、动态的信息。该研究方向在牛憨笨院士的带领下主要分三大学术思路:活细胞成像、活体动物成像及生化参量检测。在超分辨成像、荧光寿命成像、反斯托克斯拉曼散射显微成像、活动物在体成像、新型荧光探针的研发等方向都取得了长足的进展。近年来承担了多项国家及省、市级科研项目,包括科技部973课题、科技部重大仪器专项课题和国家自然科学基金重点项目等项目。发表了多篇研究论文,申请及授权了多项发明专利。多次参加国内国际学术会议及发表特邀报告。

与此同时,我们积极开展对外交流与合作。为了促进生物医学光子学的发展,扩大生物学、医学和物理学等领域的学术交流,2006年由深圳大学光电子学研究所和德国柏林Becker&Hickl GmbH发起,每年或者每两年在深圳大学联合举办生物医学光学方法高级研讨会,研讨会由来自国内外生物医学和物理学领域的专家介绍光谱学和成像技术的最新进展,及其在生物医学领域的最新应用。如2016年深圳大学光电子学研究所承办了第七届国际生物医学光学方法高级研讨会。会议主题包括:荧光寿命成像显微技术、多光子显微技术、荧光共振能量转移、组织自体荧光、荧光关联谱、光学分子成像、扩散光学层析成像、光学相干层析、表面等离子体共振、光声层析成像以及相干反斯托克斯拉曼散射成像及其在生物医学领域的应用。包括德国、英国、美国、加拿大、澳大利亚、台湾和香港地区在内的30多位中外知名学者做了专题报告。

我们还与国内外许多高校密切联系,包括美国纽约州立大学布法罗分校,美国克莱姆森大学Clemson University,美国加州大学旧金山分校,天津大学,浙江大学,华中科技大学,华南师范大学等,在生物医学光学领域展开了深入合作。

我们还以聘请客座教授的形式加强我们这一领域的师资力量,譬如美国纽约州立大学布法罗分校的P.N.Prasad教授、英国国王学院Klaus Suhling教授、德国斯图加特大学应用光学研究所的Giancarlo Perdrini教授等。此外,我们多次邀请国外有经验的教授来校进行系列讲座,介绍本领域的前沿发展,进行学术交流。本专业的老师和学生都能在这样的交流中收获良多。


 光学显微镜与电子成像课程介绍

     光学显微与电子成像是生物医学研究和临床诊断的重要工具,涉及到光学(镜头、反射镜、滤光片等)、机械和电子等,一般包括光学显微镜、CCD相机、计算机、软件和图像输出设备等。要使用好这些工具,需要了解:(1)如何准直显微镜的光学系统 ,(2)掌握如何采集电子图像,并进行必要的图像处理。 光学显微与电子成像课程包括三部分内容,即: 光学显微镜及光学成像的基本原理;光学显微技术常见模式;现代电子成像系统的组成和必要的图像处理方法。

     这是一门双语课程,通过这一课程的学习,可以–掌握光学显微镜及光学成像的基本原理 –显微镜基本技术 –电子成像的基本原理和技术 –熟悉该领域常见术语的英文表述,为以后从事相关领域的科研工作打下基础。

     在屈军乐教授的带领及多位年轻老师的积极参与下,《光学显微与电子成像》课程建设从无到有,从零散到系统,并正逐步走向成熟。结合本学科的发展现状和趋势,以及近年来的研究热点,本课程重点探究以下几个课题:

1.光学显微镜:基本原理和组成 2.宽场显微成像  3.激光扫描共聚焦显微成像  4、非线性光学显微成像  5.荧光寿命显微成像   6.超分辨光学显微镜  

    课程教学方面,我们已经结合光学显微与电子成像的教学实践,从教材及参考书选择、教学内容和形式更新、课件制作、考核形式等多方面进行了实践与探索,围绕相关学术前沿问题及相关的科研课题组织教学,同时让学生们结合相应课题,通过文献调研、实验设计及资料分析等多种手段,探讨分析问题和解决问题的途径和方法,撰写研究报告,并通过口头报告形式进行汇报,提倡学生们积极提问和讨论,在教学实践中培养学生文献阅读能力、科研思维能力、科研实践能力以及创新意识。   

    今年,本课程有幸入选为深圳大学研究生院seminar课程之一,也是学校对本课程的肯定。我们相信,在研究生院的详细指导下,在全体师生共同努力下,一定能把本课程做成开放互动、教学相长的新型研究生课程,达到预期的教学效果。


 问 题 描 述

本次课程主要重点针对光学显微与电子成像研究领域的研究热点和前沿问题开展教学与研讨。促进学生学习光学显微成像中的基本概念、相关技术方法的发展历史、实验设备以及最新进展,拓宽知识面,初步理解和掌握光学方法在显微成像领域的最新技术和应用。以此同时,在教师课堂授课的教学形式以外,在课堂上分别提出了五个研讨专题:1.共聚焦显微成像  2、多光子光学显微成像  3.荧光寿命显微成像   4.超分辨光学显微镜 5光学显微成像技术在生物医学中的应用

新入学的一年级研究生学生,通过本科毕业设计等相关训练和实践,对科学研究已经有了一定程度的认识,但发现问题解决问题的思维方式尚未成熟。本课程在提出研讨问题的同时,从多个方面提供信息、开展训练,启发学生主动思考、积极实践,从被动的知识学习向主动的科研探索转变。

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创 新 思 路

一 内容方面的创新 

首先由老师向学生讲授光学显微与电子成像的基础知识;在学生对相关领域有初步了解后,再由老师从网络上选择最前沿的科研文章,每周给三至四位学生分配不同的题目,在一周的时间内学生需要完成对相关主题的调研,做好讲解用的演示文稿;然后在一周后的课堂上由本组学生开展口头报告,向老师以及全部同学介绍自己调研的文章,讲解完毕后有十分钟时间由老师和同学自由提问。

 

二 方法方面的创新 

1.        将传统的老师传授变为师生互动。在师生互动交流过程中,学生由被动接受变为主要求知,学生的学习积极性被充分调动,大大提高学习的兴趣和效率。

2.        单向流动变成双向反馈。学生在课下的自主调研,不仅能让自己真正投入到一个知识领域,深刻掌握该领域的知识,而且能提高学生多方面的自主学习能力,包括文献检索能力、英文阅读理解能力、归纳整理能力、运用知识能力等。做课堂报告也很好地提高学生学习的投入性,增强了学生的自信心。在提问环节中,老师和同学的提问不仅能增进双方对相关问题的理解,同时也能起到查漏补缺的作用,发现报告人未能发现的问题,开拓思路。

3.    在课堂教学单一模式之上,增加校外实践学习过程。本次课程安排了一次全体学生和老师参加的学术会议(2017广东省生物物理学年会暨第十三届粤港生物物理学研讨会,于201711月在广州举办)。通过这种类型的校外实际学习活动,学生们了解到各高校相关课题组的优秀研究成果,这给大家带来了很多思想上的冲击和启发,极大地激发研究灵感,对以后的研究工作有一定的促进作用。

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老师和同学们一起参加广东省学术会议

分 析 与 论 证

本课程的过程分为三部分:一是课堂教学与讨论,二是Seminar报告部分,三是参加学术会议部分。

1.课题教学部分

   光电学院的研究生比较多,而且学科的背景也都比较复杂有学物理、电子、光学和材料等方向。本门课堂主要是以光学知识为基础,针对部分学术对光学知识了解的比较少,教师结合生活中常见的光学现象为切入点,结合基本公式推导,动画演示等手段,使同学们很快掌握了基础知识。为了让学生们更深刻的了解科研显微镜的结构和原理,上课的时候我们还将实验室的科研显微镜搬到讲台上进行现场教学,也很快的帮助同学们掌握了光学显微成像的基本原理。

2.Seminar部分

    在课题教学部分提前一个月给同学们安排好Seminar课题,各位同学根据情况选题分组,在一个月的时间内调研文献、分析问题画图做PPT,然后在Seminar部分每个同学上台讲10分钟,讲解自己关于选题内容所做的调研工作和对课题的理解,下面的同学聆听,在同学讲完后提问,在台上的同学回答台下同学的问题,当然可能也存在一些比较难的问题,这时教师在旁边帮助分析并协助同学回答问题。最后教师对每一个同学所做的PPT和讲解的内容进行综合评价并打分。教师在课程的最后还要指导学生完成课程论文的撰写。

3.组织学生参加学术会议

  由于本Seminar课程很幸运得到了学校的资助,为了充分利用好该笔经费,我们决定将该笔经费资助学生去参加学术会议,让同学们了解最新的学术动态,拓展视野。由于经费有限,因此我们只能参加省内的学术会议,经过和同学们讨论协商最后决定参加和本课程密切相关的广东省生物物理学年会暨第十三届粤港生物物理学研讨会。并要求同学们参加完会议后每一个人都交一份参会心得。此项活动得到了同学们比较好的反响。

下面是部分同学参加会议后的心得体会:

刘同学:能够参加这次2017年广东省生物物理学术大学感觉非常不错,在这次重要的会议当中我们不仅可以近距离接触光学大牛,而且还有机会了解目前生物光子学的最新研究前沿,这些研究人员的学术报告我们也可以从中获取启发,从而对自己的科研也有更全面的认知。这两天的大会报告非常精彩,每位报告专家都非常认真地、有激情地和大家分享近年来自己最新的工作成果,研究超前、成果创新、应用突破。再接下来的学习当中,应该好好规划自己怎么学,时间是有限的,但是要学的东西却很多很多,所以应该找到自己着重应该学的,像现在应该多多储备一些基础知识。通过这次听取会议以及和老师同学们的交流,自己收获很多,不仅仅是在学习上的,更重要的是看到别人的努力,认真的生活态度,这都是我应该学习的,非常感谢老师给我这次机会,让我能够和高水平的人交流探讨,学习他们的优点,提升自己的学识。

潘同学:2017129-20171210日在从化温泉酒店举办了第八届广东省生物物理学术大会。会议第一天早晨由华南师范大学的邢达教授致会议开幕词,并由暨南大学黄耀熊教授主持。会议的参会人员包括有华南师范大学、暨南大学、华南农业大学与深圳大学的师生,到会人数接近有一百多人,场面相当地热闹。会议地点也是依山靠水,让我们能在会议空闲吸上一口清新空气。会议报告的内容各种各样,有应用超分辨技术的,有纳米材料的最新研究,有生物领域的创新等等。每一个研究团队都是很努力地朝更高的水平迈进,尊重其他团队的研究成果,并希望能够为这个学会作出贡献。在报告上,邢达教授对所听到每一位报告者都提出了十分中肯的建议,也会发生一定的意见分歧,但我认为学术不总是一成不变的,不同的想法会撞击到一起,才能有更新的思路出现,这也是参加学术交流的意义所在。

陈同学:首先要感谢彭老师和严老师给我们此次机会参加2017年广东省生物物理学术大会,开阔了我们的视野和眼界。在这次大会中,我聆听到很多科研学者的报告,报告的内容覆盖了物理学、光学、医学、遗传学等学科领域,让我了解到很多关于生物医学光学传感和成像、生物分子作用机制、新型材料在生物医学的应用等方面的先进技术。其中,宽场显微定量FRET成像、超分辨显微成像、多模态光声显微成像等显微成像技术,与课程内容息息相关,对课堂上学到的显微成像知识有了进一步的扩充。学术大会上介绍的新概念、新技术对我国乃至国际上的生物医学光子学领域的研究发展有着极大的推动作用,对疾病尤其是癌症的预防和治疗产生深远的影响。各位教授学者在讲台上的演讲给予我很大的激励作用,科研的魅力无穷,能够将自己课题组的研究成果展示给大家是一件无比自豪的事情。希望今后我也可以在学术会议上作报告,分享我的研究成果,这也将促进我在学术研究上的进步。主办方为此次大会做了充足的准备,会议开展得非常顺利,得到了众多师生的好评。从化温泉镇是一个风景优美的胜地,在这里开展学术会议能够为学术交流增添几分生动,为科研活动提供了一个舒适的环境,让大家在开展科研交流的同时,也可以放松身心。通过参加这次学术大会,我不但收获了很多前沿的技术知识,而且增进了我和班里同学的沟通和交流,让彼此更加熟悉。在以后的学术大会日程中,老师可以在晚上组织同学们开展分享会,让同学们把这一天的收获跟其他同学分享,老师也可以“趁热打铁”,解答同学们的一些对报告内容的疑惑,加深同学们对知识的认识和理解。

甘同学:参加此次生物、物理学术大会,使我对 “学术”二字有了与以往不同且更深层次的理解。这不仅仅使我开阔了眼界和学识,看到了许多有趣的海报张贴,感受到了各路科学工作者以及学生的参会热情,更为重要的是听到了来自许多不同方向的科研报告以及他们的工作成果,还有他们的思维方式以及科研方法,这些都使我受益匪浅,我想在我今后的科研和学习路上都会有很大的帮助和指导作用。同时,使我深深感动和思考的是科研工作者的工匠精神,是他们的智慧和勤奋劳动才使得科研更前进一步。也让我认识到如何将理论应用于实践并且投入社会的重要性,以用来解决现实面对的难题,揭示更多生命科学的奥秘,进而推进科学技术的发展和突破,为人类做贡献。与此同时将其实际意义放大也是极为重要和关键的部分。凡此种种对我来说,都是极其难得和珍贵的收获与经历。

郭同学2017128日到20171210日,我参加了广东省生物物理学术大会暨第八届委员代表大学。作为一名学生,学习不能仅仅局限于课堂,毕竟书本的知识还是有限的。而各类学术报告正好给我们提供了一次课外学习的机会,让我们得以充实与提高。在参会期间,我学习了许多有关生物医学与物理学结合的前沿先进技术,而且活跃了学术思想和扩展了视野。最让我印象深刻的是广州华南师范大学刑达教授做的第一个报告:光声成像及光声热弹波的生物医学应用。光声成像(Photoacoustic Imaging, PAI)是近年来发展起来的一种非入侵式和非电离式的新型生物医学成像方法。当脉冲激光照射到生物组织中时,组织的光吸收域将产生超声信号,称这种由光激发产生的超声信号为光声信号。生物组织产生的光声信号携带了组织的光吸收特征信息,通过探测光声信号能重建出组织中的光吸收分布图像。报告中提出了具有原理创新的同光声成像与热弹冲击波治疗一体化新方法。而且该原创的光声显微成像技术实现了从实验室研究到临床仪器测试的跨越。他所做的报告让我更加深刻地了解光声成像在医学上的应用,让我受益匪浅。



《光学显微与电子成像》主要讲授了光学显微成像的原理、最新进展研究及应用前沿,同学们对这门课程非常感兴趣。在课程教学方面,结合近几年其他老师在本门课中的教学实践,从教材及参考书选择、教学内容和形式更新、课件制作、考核形式等多方面进行了实践与探索。围绕相关学术前沿问题及相关的科研课题组织教学,同时让学生们结合相应课题,通过文献调研、实验设计及资料分析等多种手段,探讨分析问题和解决问题的途径和方法,撰写研究报告,并通过制作PPT和课堂报告的形式进行汇报。在教学中提倡学生们积极提问和讨论,通过实践培养学生的文献阅读能力、科研思维能力、科研实践能力以及创新意识。

教学活动我们分以下几个方面展开:

1老师讲解:内容包括基础理论知识以及学科前沿动态;

2学生个人调研:选择与本课程相关的某一研究方向,自主查阅文献,解决问题,作口头报告与其他同学分享,由老师点评,最后提交研究报告。充分发挥学生的能动性,有意锻炼学生的综合能力,包括独立完成课题开展、文献查阅、口头报告等;

3)分组开展课题调研本学期提出了多个课题,由同学独立完成。要求每个同学做PPT并进行课堂汇报,老师同学参与问题讨论,最后撰写课程报告。这个过程中,调动了每个同学的积极性,锻炼了同学自主学习的能力;

(4)学术活动:该部分主要组织同学到其他院校做些学术访问、交流,或是本院组织及邀请其他院校前来交流。本学期组织同学参加了“2017年广东生物物理学年会暨第十二届粤港生物物理学研讨会会议”,积极提倡同学与中山大学、暨大、华南理工、华师等兄弟院校同方向的研究生交流心得体会,聆听各位老师的精彩报告,并向国内外本学科的知名专家提问学习。

    (5科研实践活动:参加课程的同学结合自己所调研的课题,利用课余时间参与课题组的科研项目,开展了不同方向的研究,比如超分辨成像研究、纳米颗粒的制备等,参与了光路搭建、样品制备、数据采集、图像分析等过程,并将初步的实验结果进行总结。部分同学向“2017年广东生物物理学年会暨第十二届粤港生物物理学研讨会会议”提交了会议摘要,这是一次非常好的科学实践活动。

本课程的教学活动安排,还在积极的探索中,总体而言,达到了Seminiar课程设置时的教学要求。从同学们反馈的心得来看,大家在这个课程中都得到了一定程度的锻炼与提高。本次课程教学内容较多,科研实践部分尚可进一步深入。本学年的课程通过Seminiar教学取得了较好的教学效果,希望这种好的教学模式,有机会延续下去。不足之处,我们会在以后的教学实践中不断改进。

 

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本课程的实验、调研方案主要如下:

由老师提出一些本学科相关的前沿性研究方向,同时提供一些近期发表的有代表性的相关文献,经过同学们自己借助文献调研、向老师请教、同学间沟通等方法,确定调研题目。然后通过资料的收集、掌握,制作PPT,进行课堂讲述。在此过程中,其余同学进行相关问题提问并与老师进行讨论。

 1. 共聚焦显微成像

    共聚焦成像的原理是由神经网络计算及人工智能专家马文·闵斯基(Marvin Minsky)在其1957年发表的专利中提出的。共聚焦显微成像的实现主要是引入了“扫描”和“共聚焦”两个关键技术,使得成像过程中能够对焦平面以外的信号进行抑制,从而获得较高的图像信噪比和纵向分辨率。

扫描成像方式是指该技术采用经过物镜聚焦的激光光斑来照明样品,采用点探测器(如光电倍增管PMT等)获取该点处的强度信息,并通过逐次改变样品和光斑的相对位置实现对样品的逐点逐行扫描,最后通过软件处理将各单点信号组合形成一幅图像。在进行单点成像时引入“共聚焦”的概念,即在被照明物点(物方焦点)的共轭位置(像方焦点)设置一个尺寸很小的针孔(如图1),使得只有从物方焦点发出的荧光才能透过针孔被探测器接收,而物方焦点以外(包括焦平面以外的其它层面)的荧光信号则会被针孔滤除。在整个过程中,照明点光源、物方焦点、像方焦点处的针孔三者在光学上互为共轭关系,此即为“共聚焦”的含义。该方法不仅减少了相邻点荧光信号的干扰,一定程度上提高了横向分辨率,更极大程度地降低了物方非焦平面处荧光信号的干扰,从而提高了图像的信噪比和纵向分辨率。此外,由于获取某个焦面的荧光信号时可以不受焦平面以外信号的影响,我们还可以通过逐次移动焦平面的方式来获取样品中不同层面的信息,从而实现“光学层切”,通过软件处理便可重构出生物样品的三维图像。因此,虽然扫描成像方式使得该技术相比宽场成像方式而言速度有所下降,且系统复杂程度提高,但仍然成为生物医学光学成像中应用最为广泛的技术之一。

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图1.


2.多光子光学显微成像    

     利用多光子激发荧光进行显微成像的技术称为多光子激发荧光显微成像,其中最典型的代表是双光子激发荧光显微成像,由美国康奈尔大学Webb研究小组于1990年首次实现。多光子激发荧光与前面提到的普通宽场荧光显微成像和共聚焦显微成像中荧光探针的激发过程,其不同之处在于,荧光探针被激发时,不是吸收一个光子,而是同时吸收两个或多个光子。因此相应地,我们也可以把之前提到的荧光探针吸收一个光子发射荧光光子的过程称为单光子激发荧光,如图2所示。由于基态g上的电子吸收一个或多个光子跃迁到激发态f2后会在非常短的时间内驰豫到f1态,然后再从f1态自发辐射荧光光子回到基态,因此单光子激发荧光过程所产生的荧光光子波长略长于激发波长。同样的道理,双光子激发荧光产生的荧光光子波长要略长于激发波长的一半(即荧光信号的频率略小于激发光频率的两倍),而三光子激发荧光产生的荧光信号的频率也要略小于激发光频率的三倍。不仅如此,由于吸收截面的不同,双光子激发产生的荧光信号要明显弱于单光子过程,而三光子激发产生的荧光信号则比双光子的还要弱得多。因此在多光子激发荧光显微成像中通常需要采用高能脉冲激光作为激发光源。

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2. a)单光子激发荧光;(b)双光子激发荧光;(c)三光子激发荧光

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图3.单光子激发和双光子激发形成的荧光分布

相比单光子荧光显微成像,多光子荧光显微成像的特点是光信号的产生是非线性的,激发光的波长较长且多为脉冲光。光信号产生的非线性性质导致只有激发光焦点附近的有限区域内才能满足多光子同时吸收的条件(如图3所示),这就使得焦点以外(包括焦平面以外的其它层面)并不会产生荧光,因此多光子激发荧光显微成像不需要借助共聚焦针孔就可以具有天然的光学层切和三维成像能力,通过焦点的三维扫描即可获得样品的三维显微图像。同时根据其成像原理,多光子荧光显微成像采用的激发光多为长波长的脉冲光,因此即使在峰值功率较高时平均功率也不会太高,可以有效地避免焦点外荧光探针的光漂白,并且对生物样品具有较强的穿透能力和较小的散射,适合深层组织成像。通常基于单光子激发荧光的共聚焦显微成像在生物样品中的成像深度仅为100~200微米,而多光子激发荧光显微成像则可以达到1~2毫米,这个特点使得该技术被广泛用于疾病诊断、生理过程追踪、药品测试等领域。

3.荧光寿命显微成像

荧光物质受到激发后,其分子中的电子吸收激发光子能量跃迁到激发态,随后以辐射跃迁的方式回到基态并发出荧光。由于处于激发态的电子有一段相对较短的亚稳态时间,因此当撤去激发光之后,荧光并没有马上消失,而是随着时间呈指数衰减,当荧光强度衰减到初始荧光强度的1/e时所用的时间称为荧光寿命(如图4)。荧光寿命是荧光分子本身固有的一个特征参数,它表征了荧光分子由激发态返回基态(即退激过程)的速率,与荧光分子的绝对发光强度无关。由于荧光分子的退激过程容易受到其周围微环境变化的影响,因此通过测量荧光寿命可对荧光分子周围的微环境变化进行监测,而利用荧光寿命进行显微成像的技术就称为荧光寿命显微成像。

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4. 荧光寿命示意图

荧光寿命的测量方法主要分为时域法和频域法两类。其中,时域法测量时通常选取脉冲光作为激发光源,记录荧光衰减曲线并通过指数拟合求得荧光寿命;频域法则利用经过调制的连续光激发样品,通过检测荧光信号受到的振幅和相位调制来计算荧光寿命。目前时域法测量在荧光寿命显微成像中应用相对较为广泛。为了获得退激过程的荧光强度衰减曲线,可以利用具有时间分辨能力的门控探测器(如像增强型电荷耦合器件ICCD)进行直接探测,也可以采用时间相关单光子计数法(time correlated single photon countingTCSPC)、条纹相机(streak camera)等进行间接测量。在时间相关单光子计数法中,时间轴被分成若干个通道,每个激发脉冲过后产生的荧光光子被探测器探测并根据它们到达探测器的时间在相应的时间通道上进行计数,从而累积获得一个正比于荧光强度衰减曲线的光子数-时间分布直方图,用于拟合荧光寿命。而在条纹相机法中,荧光光子被光电阴极转化为电子后,通过狭缝的电子被垂直其运动方向的扫描电场加速,不同时间到达的光电子在空间上被分开,从而时间分布被转化为空间分布以获得荧光衰减信息。在荧光寿命显微成像得到的图像中,每一像素点上的荧光寿命信息实际上对应一条荧光寿命衰减曲线。

4.超分辨光学显微镜

      传统光学显微镜由于受衍射极限限制,其分辨率极限大约为200纳米左右(式6.1)。近二十年来,随着荧光探针、激光器、探测器等相关技术的快速发展,以及生物医学对细胞内亚细胞器和大分子等进一步研究的需求,显微成像技术领域涌现出了各种可以“突破”该衍射极限的新的荧光显微成像技术,称为超分辨显微成像(super-resolution microscopySRM)。这些超分辨显微成像根据其实现原理的不同可分为两大类:一类采用超衍射极限模式的激发方式(sub-diffraction-limit pattern excitation),也称为基于点扩展函数调制或结构调制的超分辨显微成像;另一类则利用了分子定位。

本研究方向对各种超分辨率荧光显微技术,如:

·             STEDStimulated Emission Depletion fluorescence Microscopy

·             LSCMLaser Scanning Confocal Microscope

·             PALMPhotoactivated Localization Microscopy

·             STORMStochastic Optical Reconstruction Microscopy

通过文献调研,简要介绍这些方法的原理及其中的关键技术,包括之后的发展改进;简要介绍超分辨荧光显微术所用到的探针的原理及其具体应用。

   5. 光学显微成像技术在生物医学中的应用

      当今国际生物领域的前沿与热点,特别是纳米药物载体、纳米生物传感器、纳米荧光材料等的发展,在疾病的诊断、治疗和康复方面发挥重要作用,其中基于纳米材料与纳米技术的药物载体的制备研究及其抗癌药物的靶向输运对人类重大疾病,如肿瘤的治疗具有重大意义。

本课程的研讨方式是每位同学根据老师给出的几个大的研究方向,通过调研确定自己的小方向,并通过调研、讨论等方法围绕主题进行展开。整体研讨步骤及案例如下:

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学生上台讲PPT

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课堂讨论图片


下面是部分同学对课程的评价:


贺同学:

有幸随课程《光学显微与电子成像》的同学与老师参加了2017年广东省生物物理学术大会,这也是本人进入大学以来的头一次。在青山绿水掩映下的从化给我们带来了不同于往日城市中难得的静谧,学术大会在此地举行恰如其分。听到了来自各方学者的报告十分受益,尽管坐在后排与讲台有点儿远,依然能够感受到专家们治学之严谨,研究之深入,想要拥有这样的学术功底真是非一日之寒啊。通过这次听会以及和同学们的交流让我不禁感到自己的知识贮备和自主思考能力的不足,已经读了研一的我现在还是只局限于做老师布置的内容,非常缺乏自主性,不过这次会议给了我启发:平时对事情要有自己的看法,对未来要有长远的规划,不可日复一日按部就班的度日,相信通过努力我的思维能力、认知水平会逐步提高!


李同学:

参加完本次会议后,从各个研究课题组中了解了光学和医学的紧密联系,深切感受到各个学科之间都在快速的发展,而学科之间都是相辅相成的。从邱小忠教授的演讲中知道,相关的医学工作的进行是要建立在足够强的光学设备以及足够扎实的化学方面的实验能力的基础上的。比如弹性材料的制备就需要探究其化学性质和物理性质,具体应用到小动物的细胞或者组织上面的时候则需要足够高分辨率、精准的光学设备,随着研究的进展,甚至需要实现细胞的长时间活性观测和追踪的光学设备。可以说物理学、化学、材料学、生物学、光学这几门学科构成了生物光子学,这几门学科的研究工作都密不可分、相辅相成的。

刘同学:

能够参加这次2017年广东省生物物理学术大学感觉非常不错,在这次重要的会议当中我们不仅可以近距离接触光学大牛,而且还有机会了解目前生物光子学的最新研究前沿,这些研究人员的学术报告我们也可以从中获取启发,从而对自己的科研也有更全面的认知。这两天的大会报告非常精彩,每位报告专家都非常认真地、有激情地和大家分享近年来自己最新的工作成果,研究超前、成果创新、应用突破。再接下来的学习当中,应该好好规划自己怎么学,时间是有限的,但是要学的东西却很多很多,所以应该找到自己着重应该学的,像现在应该多多储备一些基础知识。通过这次听取会议以及和老师同学们的交流,自己收获很多,不仅仅是在学习上的,更重要的是看到别人的努力,认真的生活态度,这都是我应该学习的,非常感谢老师给我这次机会,让我能够和高水平的人交流探讨,学习他们的优点,提升自己的学识。

陈同学:

首先要感谢彭老师和严老师给我们此次机会参加2017年广东省生物物理学术大会,开阔了我们的视野和眼界。在这次大会中,我聆听到很多科研学者的报告,报告的内容覆盖了物理学、光学、医学、遗传学等学科领域,让我了解到很多关于生物医学光学传感和成像、生物分子作用机制、新型材料在生物医学的应用等方面的先进技术。其中,宽场显微定量FRET成像、超分辨显微成像、多模态光声显微成像等显微成像技术,与课程内容息息相关,对课堂上学到的显微成像知识有了进一步的扩充。学术大会上介绍的新概念、新技术对我国乃至国际上的生物医学光子学领域的研究发展有着极大的推动作用,对疾病尤其是癌症的预防和治疗产生深远的影响。各位教授学者在讲台上的演讲给予我很大的激励作用,科研的魅力无穷,能够将自己课题组的研究成果展示给大家是一件无比自豪的事情。希望今后我也可以在学术会议上作报告,分享我的研究成果,这也将促进我在学术研究上的进步。

张同学:

这次我们随着彭老师去和严老师参加广东省生物物理学术大会,实属是十分幸运,能在研究生一年级就去参加这么隆重的学术大会。大会中,有来自广东省各个学校的老师和学生,当中很多人是带着一定的学术成果来与我们分享的,短短两天时间,他们在上面尽力地告诉我们生物物理方面的进展,让我们接触到了生物材料、光学等方面最前沿的东西。我相信这对我们以后的研究是有帮助的。所以很感谢有这样的机会让我们去开拓视野,了解学术前沿。希望以后学弟学妹们也能有这样的机会去交流。