Seminar课程

植物基因组学 / 生命科学学院 / 黄腾波

植物基因组学课程背景

1.什么是基因组学?

基因组一词是1920年Winkles从GENes和chromosOMEs组成的。其中,基因组(genome)是1924年提出用于描述生物的全部基因和染色体组成的概念。1986年由美国科学家Thomas Roderick提出的基因组学(Genomics)是指以分子生物学技术、计算机技术和信息网络技术为研究手段,以生物体内全部基因为研究对象,在全基因背景下和整体水平上探索生命活动的内在规律及其内外环境影响机制的科学,简单地定义为研究基因组结构和功能的科学。在人类基因组计划(HGP)的影响下,分子生物学的主要目标已经从传统的单个基因的研究转向对生物整个基因组结构与功能的研究。生命科学正从全新的视觉角度研究与探讨生长与发育、遗传与变异、结构与功能以及健康与疾病等生物学与医学基本问题的分子机理,并形成了一门新的学科分支---基因组学。


blob.png

 

图1  人类基因组计划(HGP)(Brown TA,2007)


2.基因组学的研究内容?

基因组学目前研究主要包括三个不同的亚领域:(1)结构基因组学(structural genomics)以全序列测序为目标,构建高分辨率的以染色体重组交换为基础的遗传图谱和以DNA 的核苷酸序列为基础的物理图谱,最终完成全基因组序列测定和注解。(2)功能基因组学(functional genomics),即后基因组计划,是结构基因组研究的延伸,利用结构基因组提供的信息,在基因组或系统水平上全面分析基因的功能,使生物学研究从对单一基因或蛋白质研究转向对多个基因或蛋白质同时进行的系统研究,是在基因组静态(碱基序列)清楚后转入对基因组动态(生物学功能)的研究,其任务是进行基因组功能注释(Genome annotation),了解基因的功能,掌握基因的产物及其在生命活动中的作用,从基因组的整体水平上来理解基因的功能与进化。(3)比较基因组学(comparative genomics),是基于基因组图谱和测序基础上,对已知的基因和基因组结构进行比较,来了解基因的功能、表达机理和物种进化的学科,研究内容分为两个方面:种间的比较基因组学和种内的比较基因组学。


blob.png

基因测序技术发展过程

blob.png

3  传统的Sanger测序法及新一代DNA测序技术工作流程图(Shendure and Ji, 2008

3.基因组学有哪些研究手段和方法?

植物基因组学是当前植物学最前沿的领域之一。以此同时,植物功能基因组学是一个崭新的研究领域,其研究方法也日趋完善。主要包括扩增性片段长度多态性、基因表达系列分析技术、转座因子、生物芯片和生物信息学等(王章建,2008)。同时,目前应用最多的基因组编辑技术主要包括锌指核酸酶 (zincfinger nucleases,ZFNs)(Bibikova et al., 2008; Dreier et al.,2005 ),类转录激活因子效应物核酸酶 (tarnscirption activator-like nueleases, TALENs)(Shan et al., 2013; Hockemeyer et al.,2011 )以及被《Sciencec》评为2012年十大重要科学进展之一CRISPR/Cas9系统的基因组编辑技术(Karginov et al.,2010),利用基因组编辑技术不仅对植物基因进行改造也为研究植物功能基因开辟了新的研究领域,同时基因组编辑技术也是进行农作物遗传改良的重要辅助手段。

 

blob.png

4  CRISPR-Cas9系统在植物中的应用(Khaoula et al.,2013

基因组学研究已进行了30 余年,在看到基因组学取得重大研究进展的同时,也应看到当前基因组学研究存在诸多的问题。从理论到应用需要一定的时间作为过渡,可喜的是已有越来越多的基因组工作者认识到这些重要问题,可见,在基因组学的新纪元里,我们需要重新调整对基因组学和基因组生物学的认识。

 

 

参考文献

[1] Brown TA.Genomes there[M]. New York.Garland Science.2007.

[2] Shendure J, Ji H. Next–generation DNA sequencing[J]. Nat Biotechnol, 2008, 26(10): 1135–1145.

[3] 王章建,高伟,常泓植物功能基因组学研究方法[J].安徽农业科学.200937(20)9375-9376.

[4] Bibikova  M, Golic M, Golic KG,et al.Targeted Chromosomal Cleavage and Mutagenesis in Drosophila Using Zinc-Finger Nucleases[J].Genetics.2002,161(3):1169-1175.

[5]Dreier B,Fuller RB,Segal DJ,et al.Development of Zinc Finger Domains for Recognition of the 5’-ANN-3’ Family of DNA Sequences and Their Use in the Construction of Artificial Transcription Factors[J].J Biol chem.2005,280(42):35588-35597.

[6]Shan QW,Wang YP,Chen KL,et al.Rapid and Efficient Gene Modification in Rice and Brachypodium Using TALENs[J].Mol Plant.2013,6(4):1365-1368.

[7] Hockemeyer  D, Wang HY,Kiani S,et al.Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases[J].Nat Biotechnol.2011,29(8):731-734.

[8] Karginov FV,Hannon GJ.The CRISPR system:small RNA-guided defense in bacteria and archaea[J].Mol Cell.2010,37(1):7-19.

[9] Khaoula B;Angela CG; Sophien K,et al. Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system[J]. Plant Methods.2013, 9(39):1-11.



本次课程主要重点针对植物基因组学开展教学与研讨。使学生系统学习植物基因组学的理论知识,了解植物基因组学的发展历史,掌握植物基因组学的数据分析方法及近年最新的分子技术。以此同时,在课堂上分别提出了三个研讨专题:一是RNA-seq研讨专题;二是ChIP-seq研讨专题;三是DNA甲基化研讨专题。

(一)RNA-seq研讨专题

小组成员:刘乃嘉、齐冰琳、邱佑、宋健、谭芳美

我国油菜种植面积和总产量一直位居世界前三位,是关系到国民生计的重要经济作物。此外,油菜制造生物柴油的前景也被各国看好,具有十分重要的战略意义。油菜对重金属离子有较强的吸收能力,容易受到Cd、Pb等重金属的污染,因此研究这些重金属对油菜生长以及基因表达,尤其是microRNA表达的影响具有很重要的理论与实践意义。

(二)ChIP-seq研讨专题

小组成员:秦换、郑朝、张茂娜、金叶、林佳超

转录因子A通过促进转录因子B来调节叶片生长。研究A和B的下游的基因调控网络,是目前基因组学的研究热点。运用ChIP测序和RNA-sequencing两种基因组学的方法来研究A和B的下游的基因调控网络将为分析这两个转录因子作用的生物学机理奠定重要基础。

 (三)DNA甲基化研讨专题

小组成员:王永益、陆佳运、江曾明、李民旭、吴聪

          表观遗传学是指基因序列没有改变或者突变的情况下,基因的功能被改变从而使得生物体的表型得到相应的变化的一门遗传学分支学科。DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰。在植物中,甲基化可以通过RNA介导的甲基化(RNA-dependent DNA MethylationRdDM)通路所建立。RDR2RNA Dependent RNA polymerase 2)是RdDM通路中的一个重要组分,是大小为24nt的异染色质siRNAhc-siRNA)生物来源所必须的。但是RDR2在调控DNA甲基化过程中的具体功能还缺乏全面的了解,因此详细分析RDR2DNA甲基化中发挥的关键作用对植物表观遗传研究有着重要的理论意义。


(一)油菜镉胁迫相关microRNA及其靶基因的差异表达

植物应答镉胁迫转运通过土壤—>根—>茎—>叶的途径进。而植物应答镉胁迫的机制包括:1.限制镉的吸收和转运;2.在非生理活性部位对镉进行固定和隔离;3.渗透压调节及功能蛋白提高;4.络合解毒机制;5.抗氧化防卫机制;6.胁迫蛋白协同作用。这些作用机制被microRNA影响,microRNA与其靶基因相互作用是植物影响环境胁迫的主要调控因子。为了详细研究 microRNA及其靶基因受镉胁迫的影响。

本研究方案将采取以下设计思路及方法

1. 实验流程:

blob.png


2.实验方案

1)实验材料准备

镉胁迫处理株:用氯化镉处理生长20d左右的植株(仅参考,具体时间要由实验确定)。

正常株对照:正常处理,对照。

2)总RNA提取

取镉胁迫处理后0、6、12、24、48h分别区幼苗根、茎、叶,按照试剂盒指示说明提取总RNA,并用琼脂糖凝胶电泳和测OD比(A260/A280)对其完整性和纯度进行检测和鉴定。

3)筛选差异表达的microRNA

分别建立镉胁迫处理和正常培养油菜的小RNA库,测序,取同源片段上下游100bp用软件预测可能的microRNA。

4)验证microRNA

方法:qRT-PCR、Northern blot

5)预测靶基因

将验证得到的microRNA输入到TAPIR 、PMRD、psRNA -Target三个miRNA数据库中下游靶基因的预测。

6GO富集与镉胁迫调控相关基因

将上一步的预测结果做GO富集分析,得到与调控相关的基因

7)验证靶基因与microRNA互作

利用降解组测序法验证

8)基因表达量的分析

方法:western blot

(二)转录因子A通过促进转录因子B来调节叶片生长

基因的转录调控是生物基因表达调控层次中最关键的一层, 转录因子(TFs)通过特异性结合调控区域的DNA序列来调控基因转录过程。由于同一转录因子往往同时调控若干个基因, 同时不同转录因子通过相互作用也可以协同调控同一靶基因, 转录因子与靶基因之间的相互作用也具有不同程度的特异性和亲和性, 所以不同基因上的结合位点保守性较弱。转录因子结合实验(transcription factor assay)、电泳迁移率变动分析(electrophoretic mobility shiftassay)、DNase I足印法(DNase I footprinting)、酵母单杂交系统等实验技术是识别转录因子结合位点的传统方法。虽然, 这些技术可以逐一鉴别出与特定转录因子结合的DNA序列片段, 但由于它们很难充分反映生理情况下DNA与蛋白相互作用的真实情况, 也很难捕捉到在染色质水平上基因表达调控的动态瞬时事件, 加上昂贵的费用及较长的时间花费显然已不适合开展后基因组时代DNA转录因子结合位点的鉴定。近年, 染色质免疫沉淀技术(ChIP)被广泛用于研究体内转录调控因子与靶基因启动子上特异性核苷酸序列的结合, 并已成为研究染色质水平基因表达调控的最标准有效的方法。ChIP-Seq技术凭借其对DNA分子序列及丰度的双重解析能力, 已广泛应用于转录因子分子调控机制方面的研究。

在本实验计划中,根据文献设计转录因子A、转录因子B过表达载体,然后将其分别用农杆菌转化法转进植物,使其在植物叶片中过表达。并转录因子A、转录因子B缺失突变体。第二步,取A过表达叶片和B过表达叶片研磨,用ChIP技术可以得到转录因子A结合的基因和转录因子B结合的基因,再将两者之间进行多序列比对,找到A和B共同直接作用的基因。最后,A过表达叶片用ChIP技术可以得到转录因子A结合的基因;再用A突变体叶片和野生型做RNA测序,找到与A相关的基因。两者之间进行比较,即可得到被A间接调控的基因。将被A间接调控的基因与和转录因子B结合的基因进行比较,最后即可得到A通过调节B而调控的基因。

 本研究方案将采取以下设计思路及方法


blob.png

 

(三)RDR2对拟南芥全基因组水平甲基化的影响

DNA甲基化是指在真核生物中,胞嘧啶或者腺嘌呤被DNA甲基转移酶(DNMTs)将S-腺苷高半胱氨酸(SAH)的一个甲基加到C的5’-碳上,形成5-甲基胞嘧啶(5mC)。DNA甲基化一般多发生在转座子、功能基因的编码区和逆转录病毒衍生的重复序列;其发生的途径目前已知的有两种,DNA甲基转移酶和RdDM途径。其中,RNA-dependent DNA methylation (RdDM)RdDM是RNA-依赖的DNA甲基化途径,它需要RDR2的参与才能招募DNA甲基转移酶将DNA甲基化。

Whole Genome Bisulfite Sequencing(WGBS)全基因组重亚硫酸盐甲基化测序(WGBS)是目前用于全基因组甲基化测序最成熟的技术手段。WGBS将重亚硫酸盐(Bisulfite)处理方法和Illumina高通量测序平台相结合,对有参考基因组信息的物种进行全基因组范围内的甲基化水平的测序。可以精确到单碱基分辨率,精确分析每一个C碱基的甲基化状态,从而构建全基因组甲基化图谱。

本研究方案将采取以下设计思路及方法

1.实验设计


blob.png


2.rdr2-缺陷拟南芥突变体的获得

rdr2-缺陷拟南芥突变体可直接从拟南芥生物资源中心(ABRC)购买。种子号为SAIL_1277_H08,为T-DNA插入缺失(pDAP101)。RDR2在拟南芥信息资源(TAIR)的基因号为AT4G11130。ABRC 网址为:http://abrc.osu.edu/

3.rdr2过表达转基因拟南芥的获得

构建rdr2表达载体——pCAMBIA1300-rdr2:获取RDR2基因序列,用AatII与PspXI酶切位点进行酶切连接。然后通过根瘤农杆菌侵染拟南芥花序的进行转化,利用含有卡那霉素的1/2MS培养平板进行筛选。最后利用western blot进行rdr2过表达转基因植株进行验证以排除假阳性。上述所说的rdr2-mock为在同等条件下转入pCAMBIA1300空白质粒的拟南芥。


(一)油菜镉胁迫相关microRNA及其靶基因的差异表达

1.预期的实验结果

 (1)已知可能的miRNA及其靶基因

以往文献报道已经发现了一系列对油菜镉胁迫有关的micro RNA及其靶基因(如下表所示),这些miRNA及靶基因理论上将在本实验不同处理中出现表达变化,可以作为实验的阳性对照来证明实验系统的可靠性。

blob.png

2)其他植物中与镉胁迫有关的microRNA

由于植物的非生物胁迫的相关基因有一定的保守性,因此在其它种类的植物中对镉胁迫有应答的基因可能也会出现在油菜的镉胁迫应答中。已有文献报道,具体的microRNA如下图所示:

blob.png

3)未知的microRNA

由于物种的特异性,植物之间除了有保守的microRNA来对抗非生物胁迫以外,还存在自己特异的microRNA,因此,油菜中这些自己特有的microRNA就需要通过一系列的实验进行鉴定筛选。

4)上下调作用结果预测

经过实验,筛选到特定的靶基因及其下游靶基因,表达量验证结果是:(1)上调作用miRNA的qRT-PCR结果显示Ct值变小,NB、WB表达量增加;(2)下调作用miRNA的qRT-PCR结果显示Ct值变大,NB、WB表达量减少。

 

(二)转录因子A通过促进转录因子B来调节叶片生长

在整个实验过程中,需保证每一步的准确性,才能得到可靠的实验结果。在设计了转录因子A、转录因子B过表达载体,然后将其分别用农杆菌转化法转进植物,使其在植物叶片中过表达时,需要验证我们的过表达载体是否正确,其所表达的转录因子是否正确。可以加一个验证实验来验证。同时也可以将设计的过表达载体转进缺失突变体,看其是否会回复突变。如果缺失突变体能回复,那么设计的过表达载体及其表达的转录因子就是正确的,反之,则错误。另外,根据实验,最终得到了A和B共同直接作用(共同促进及抑制)的基因,以及A通过调节B而调控(即被B直接调控而被A间接调控)的基因。但由于ChIP-Seq技术也会存在着一定的误差,所以需要通过一些实验来验证这些基因是否调控叶片生长。可以挑一些感兴趣的基因,也可以是全部的基因,利用一些方法,例如化学诱变剂EMS、基因敲除、基因沉默等方法来验证这些基因是否与叶片生长有关。

 

(三)RDR2对拟南芥全基因组水平甲基化的影响

1.预期的实验结果

1)对于rdr2-缺陷:

rdr2-缺陷拟南芥的全基因组水平的甲基化程度下降;rdr2-缺陷拟南芥的全基因组水平的甲基化程度不变。

2)对于rdr2过表达:

rdr2过表达的转基因拟南芥的全基因组水平的甲基化程度增加;rdr2过表达的转基因拟南芥的全基因组水平的甲基化程度不变。

2.预期结果的讨论

对于rdr2-缺陷,其全基因组水平甲基化程度不变可能的原因是,在rdr2-缺陷突变体内具有功能与rdr2类似的蛋白酶。当rdr2功能缺失后,该蛋白酶充当了rdr2的功能角色,使得RdDM途径行驶正常的功能。

对于rdr2过表达,其全基因组水平甲基化程度不变可能的原因是,在RdDM途径中,rdr2增多,使得其产物dsRNA增多,进而24ntsiRNA增多,但是与siRNA结合的AGO4的浓度不变。当AGO4siRNA结合达到饱和时,RdDM途径也不能使得基因组水平的甲基化程度增加。

 


《植物基因组学》是生命与海洋科学学院近学年开设的一门新课程,这门新课程同时也得到研究生部的Seminar 课程的支持,同学们对这门课程的兴趣也很大。在课程教学方面作了与传统教学模式的更改,结合近年来植物基因组学的热点话题,围绕相关学术前沿问题及相关的研讨专题组织教学,同时让学生们结合相应研讨专题,通过文献检索、资料分析及实验设计等多种手段,探讨分析问题和解决问题的途径和方法,撰写研究报告,并通过课堂口头报告形式进行汇报,提倡和鼓励学生们积极参与和学习互动,学生较好地达到了学习目的,取得了较理想的学习效果。同时,在教学实践中培养学生文献阅读能力、科研思维能力、科研实践能力以及创新意识。

 由于本课程是一门全新的课程,故本课程的教学活动,还在积极探索中。有些课程安排,以及学生课题设计等方面的具体问题,还存在很多不足之处。在今后的课程中,任课老师将继续致力于将实验室的科学研究与本课程课堂教学有机联系在一起,设计出更有启发意义的研究题材供同学思考、讨论,争取能获得更好的效果。


hello world

《植物基因组学》课程学习分为两个阶段:一是教师的课堂理论教学;二是课程相关专题研讨。

一、教师的课堂理论教学

从植物基因组学的课程背景方面,向学生系统讲述植物基因学的基本理论知识,包括基因学的发展历史、定义、意义和应用,学科的理论原理,技术方法等。

二、课程相关专题研讨

根据在课堂上分别提出的三个不同专题进行研讨。总体方案如下:

1.文献检索:根据提出的三个不同研讨专题,设立3个研讨小组,学生选择研讨专题之后,结合各自的研讨方向和通过文献检索查找研讨专题相关信息,也可以在此基础上进行研究创新。

2.专题报告:通过小组内学生讨论以及教师参与互动,由学生各自就自己负责的专题写出报告,然后小组推选1人为报告者,做课堂口头报告,接受同学的提问,并对问题进行讨论,以让每位同学充分了解技术方法、可能获得的结果等,最后,完成小组研讨专题报告。

3.评委点评:报告申请邀请了宋剑波(小分子RNA及DNA甲基化研究领域专家)、余泓漾(转录因子调控网络分析专家)和林冬波(作物发育及基因功能分析专家)作为评委,每个小组先进行20分钟口头汇报,评委提问10分钟,根据任课老师及评委打分决定每个小组的最终成绩。


(一)     教师课堂授课

教师向学生系统讲述植物基因学的基本理论知识,包括基因学的发展历史、定义、意义和应用,学科的理论原理,技术方法。

现场效果图:

blob.png

 

blob.png

 

 

(二)平时课堂研讨

检索查找植物基因组学相关报道文献,通过学生之间的互动与讨论以及教师参与,学生在课堂上做文献阅读报告。

现场效果图:

blob.png

blob.png

 

(三)研讨专题

研讨专题一:RNA-seq研讨专题

研讨题目:油菜镉胁迫相关microRNA及其靶基因的差异表达

报告人:刘乃嘉、齐冰琳

现场效果图:

blob.pngblob.png

 

研讨专题二: ChIP-seq研讨专题

研讨题目:转录因子A通过促进转录因子B来调节叶片生长

报告人:郑朝

现场效果图:

blob.png


研讨专题三:DNA甲基化研讨专题

研讨题目:RDR2对拟南芥全基因组水平甲基化的影响

主讲人:王永益

现场效果图:

blob.png

 (四)评委点评

每个小组都清晰、准确的完成了专题的报告任务,一致获得了评委老师的好评,以此同时,评委老师为学生提出了宝贵的建议和意见,对此课程的教学也给予了肯定。

现场效果图:

blob.png

blob.png

 


李民旭

植物基因组学这门课的前面部分主要包括植物基因组学相关的基本概念、文献阅读、实验技术的介绍以及小组讨论汇报。这一部分,黄腾波老师进一步让我们深化了相关植物基因组学的背景知识,并且教会了我们一些文献阅读的基本方法。此外,小组讨论和汇报让我们在科研素养的培养方面有很大的促进作用,并且提高了我们做报告的自信。后半部分主要由高磊老师教授关于植物基因组、转录组、蛋白质组等方面的数据分析。这部分的内容非常有趣,因为涉及相关生物信息学的软件以及相关生物学的计算机语言。我们在高老师的指导下,应用相关软件或计算机语言,对拟南芥的相关组学数据进行了分析。这部分提高了我们看待和处理生物学信息的鉴别能力,拓宽了我们对生物学研究工具的视野。

 

齐冰琳

老师通过基础知识的讲解以及对于问题的讨论,使我们了解了关于基因组学方面的知识。在课堂之后还会有相应的文献阅读,然后大致的讲解文献的内容以及课堂的讨论。我觉得这是一个很好的教学,在课堂上学习之后,在对相关知识的文献阅读,使得我们队知识的了解和巩固更加深刻了。同时,老师还教了我们怎样使用一个软件来用于生物方面的数据分析,觉得这个方面的教学很有用处。在课堂生老师能够和我们一起讨论、提问,而且知识丰富,很能够集中大家的注意力。在这个课程上觉得学到了很多有用的知识。

 

林佳超              2160180438

在研究生的第一学期我选修了黄腾波老师和高雷老师共同开设的植物基因组学课程,在这一学期的课程当中我受益良多。

两位老师授课认真,细致,专业基本知识过硬,能充分利用时间,能以饱满的精神为学生讲每一堂课,并积极与学生进行互动,努力使课堂气氛活跃轻松,积极调动学生的兴趣。课程设置合理,课堂采用了教师讲授和学生演讲相结合的方式,这既丰富了课堂内容,又极大的锻炼了我们的自主学习能力和表达能力。同时,对学生进行分组后发布课堂作业,这也提高了我们的合作沟通能力。

我所在的是研究植物抗逆的课题组,主要进行拟南芥及番茄的相关研究。植物学家越来越认识到对一个模式植物展开全面的分子生物学研究的重要性,越来越多的事实表明,对这些遗传及基因组背景相对简单的模式生物的研究将有助于人们对其他复杂的生物的研究及认识。黄腾波老师讲授的关于植物基因组方面的知识,包括植物基因组研究的发展过程以及研究植物基因的相关理论知识和实验技术,对于我了解和掌握自己所做的研究课题有很大的帮助。生物信息学的主要任务是组织和分析生物学数据,而生物学数据的分析离不开计算机算法的运用。因此,可以说生物信息学是一门集生命科学、计算机科学、数学、物理学为一身的多学科交叉的前沿学科。高雷老师讲授的生物信息学方面的知识则让我近距离的认识了一个生物研究当中的新兴工具,通过学习相关技能也使我清晰的意识到由计算机推动的生物信息学在生物研究当中的巨大作用。

 

王永益

我叫王永益,在研一的第一个学期修读了黄腾波老师与高雷老师的<植物基因组学>这门课程,在此我对此课程的学习与体会书写于下:

<植物基因组学>这门课程主要以理论知识为主,授课方式灵活多样(课程讨论,文献解读,中英文讲解,利用互联网),学生自我感觉良好,易于接受。该课程的授课对象主要是植物学专业之学生,课程知识的安排从简到繁,从浅入深,合乎情理逻辑,学生接受程度高。

当今社会是大数据的社会,该课程通过生物信息学知识,以大数据知识库为背景,传授学生分析基因组以及sRNA库之知识,以更好的对接与解决往后研究中所需。通过一学期的该课程学习,学生收获很多,从大体上了解植物基因组之迷惑,也入门学习了生物信息分析技术。但学生有些遗憾之感,每周两个课时或许有些不足,希望老师可延长至三个课时,特别是对于生物信息知识,既要理论,又要电脑操作,两个课时的时间难免有些不充裕。

学生在此真诚感谢两位老师为该课程与学生的辛苦付出,祝愿该课程越来越好。